Campo nutracêutico: métodos para distinguir os lipossomas verdadeiros dos pseudolipossomas (misturas simples)

Lógica principal do julgamento: três características essenciais dos lipossomas verdadeiros de grau alimentício

Métodos de Distinção Hierárquica (Adaptado para Cenários de P & D/Produção de Alimentos, do Simples ao Preciso)

(I) Triagem rápida básica (nenhum equipamento complexo necessário, adequado para julgamento preliminar de oficina/triagem de matéria-prima)

1.Observação visual + microscopia (triagem preliminar morfológica)

...Operação: Diluir uma pequena quantidade de amostra com água purificada, cair em uma lâmina de vidro e observar sob um microscópio óptico (400-1000x); ou mancha com 0,1% de azul de metileno (vesículas de lipossoma aparecem como anéis azuis claros).

...Resultado Julgamento:

▪Lipossomas verdadeiros: O sistema é uma emulsão translúcida uniforme sem precipitação óbvia, com partículas esféricas/quase esféricas dispersas (tamanho de partícula 50-1000nm);

▪Pseudolipossomas: O sistema é propenso a estratificação e precipitação, sem morfologia fixa, apenas partículas de ingredientes nutricionais visíveis ou floculados fosfolipídicos.

1.Teste de separação de centrifugação (EE triagem preliminar)

...Operação: Tome 1mL de amostra, centrifugue a 10000rpm por 10 minutos, colete o sobrenadante e detecte a concentração de ingredientes nutricionais no sobrenadante usando UV-VIS ou HPLC.

...Resultado Julgamento:

▪Lipossomas verdadeiros: as vesículas não são facilmente quebradas e a concentração de ingredientes livres no sobrenadante é baixa (EE alto);

▪Pseudolipossomas: Os ingredientes nutricionais são facilmente precipitados ou completamente dissolvidos no sobrenadante (a concentração do sobrenadante está próxima da concentração total, EE~ 0).

1.Teste de difusão do saco de diálise (verificação do efeito de encapsulamento)

...Operação: Carregue a amostra em um saco de diálise (MWCO = 10-50kDa, maior do que as moléculas do ingrediente nutricional, mas menor do que o tamanho de partícula do lipossoma), dialise em um grande volume de tampão (simulando o ambiente do fluido corporal) por 2-4 horas, e detectar a concentração do ingrediente no dialisado externo.

...Resultado Julgamento:

▪Lipossomas verdadeiros: os ingredientes são encapsulados em vesículas, incapazes de passar pela membrana de diálise, e a concentração externa de fluidos é baixa;

▪Pseudolipossomas: Os ingredientes se difundem livremente e a concentração externa de fluidos está próxima da concentração total da amostra.

(II) Verificação precisa de laboratório (P & D de produtos de qualidade alimentar/confirmação de controle de qualidade)

1.Tamanho das partículas e análise do potencial Zeta (Verificação da uniformidade estrutural)

...Instrumento: Dispersão de luz dinâmica (DLS)

...Indicadores chave:

▪Lipossomas verdadeiros: distribuição de tamanho de partícula uniforme (PDI .3), potencial zeta geralmente-20 ~-50mV (carga negativa natural de fosfolipídios), valores estáveis;

▪Pseudolipossomos: Distribuição de tamanho de partícula extremamente ampla (PDI> 0,5), nenhum potencial zeta fixo (dispersão desigual de fosfolipídios e ingredientes, grandes flutuações potenciais).

1.Observação de Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) (Padrão Ouro Estrutural)

...Operação: Mancha a amostra com ácido fosfotungstico para coloração negativa e observe sob TEM (resolução de nível nm).

...Resultado Julgamento:

▪Lipossomas verdadeiros: vesículas fechadas distintas formadas por bicamadas fosfolipídicas são claramente visíveis (estruturas em forma de anel preto com núcleos aquosos);

▪Pseudolipossomas: Sem estrutura vesicular, apenas agregados fosfolipídicos irregulares ou partículas de ingredientes nutricionais (sem características de bicamada).

...Nota: O Cryo-TEM pode ser usado para amostras de qualidade alimentar para evitar que os resíduos de manchas afetem a avaliação de segurança.

1.Determinação da eficiência de encapsulamento (EE) (indicador quantitativo do núcleo)

...Princípio: Separe os ingredientes livres dos ingredientes encapsulados e calcule a proporção de ingredientes encapsulados para os ingredientes totais (EE % = (Ingredientes livres de ingredientes totais)/Ingredientes totais × 100%).

...Métodos adaptáveis comuns de grau alimentício:

▪Cromatografia de Filtração em Gel (G-50 Sephadex/Coluna G-100): Separe os lipossomas de ingredientes livres de pequenas moléculas para quantificação;

▪Ultrafiltração Centrifugação: Manter os lipossomas com membranas de ultrafiltração, permitindo a passagem de ingredientes livres para detecção;

▪Método HPLC: Quantificar precisamente vestígios de ingredientes ativos em alimentos (por exemplo, polifenóis, vitaminas).

...Resultado Julgamento: EE ≥ 20% (para ingredientes solúveis em água, como vitamina C) ou ≥ 30% (para ingredientes solúveis em gordura, como DHA) indica lipossomas verdadeiros; EE % indica um sistema de mistura simples.

1.Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) (Verificação de Transição de Fase Fosfolipícida)

...Princípio: A interação entre ingredientes nutricionais e bicamadas de fosfolipídeos em lipossomas verdadeiros altera a temperatura de transição de fase característica (Tc) dos fosfolipídios; o Tc dos fosfolipídios em misturas simples é consistente com fosfolipídios puros.

...Resultado Julgamento:

▪Lipossomas verdadeiros: alargamento do pico de transição de fase e deslocamento Tc (por exemplo, Tc diminui após a incorporação de vitamina E);

▪Pseudolipossomas: o pico de transição de fase é idêntico aos fosfolipídios puros (sem interação ingrediente-fosfolipídeo).

1.Determinação da curva de liberação in vitro (verificação de eficiência de absorção)

...Operação: Use o método do saco de diálise para simular o ambiente gastrointestinal (pH = 1,2 solução de ácido clorídrico → pH = 7,4 tampão) e determine a quantidade de liberação do ingrediente em diferentes pontos de tempo.

...Resultado Julgamento:

▪Lipossomas verdadeiros: curva de liberação suave, taxa de liberação cumulativa 48 horas (proteção de liberação sustentada, redução da destruição do ácido gástrico);

▪Pseudolipossomas: taxa de liberação cumulativa> 90% em 12 horas (exposição rápida, sujeita à degradação).

(III) Verificação Avançada (Cenários de Suplemento Alimentar de Alta Demanda/Dietético)

1.Observação de microscopia de varredura a laser confocal (CLSM)

...Operação: Rotular fosfolipídios com sondas fluorescentes (por exemplo, DiI para rotulagem de duas camadas) e ingredientes nutricionais (por exemplo, FITC para rotulagem de peptídeos) e, em seguida, observar a distribuição de fluorescência.

...Resultado Julgamento:

▪Lipossomas verdadeiros: sobreposição de dois sinais de fluorescência (ingredientes encapsulados em lipossomas);

▪Pseudolipossomas: Separação de dois sinais de fluorescência (sem ligação fixa entre ingredientes e fosfolipídios).

1.Dispersão de raios X de pequeno ângulo (SAXS)

...Princípio: As bicamadas fosfolipídicas dos lipossomas verdadeiros produzem picos de difração característicos (em torno de 2θ = 20 °), que estão ausentes em misturas simples.

...Julgamento do resultado: Presença de picos de difração característicos → Lipossomas verdadeiros; Ausência de picos característicos → Pseudolipossomas.

Mal-entendidos comuns e lembretes importantes na área de alimentos

1.Incompreensão 1: "Emulsão = Lipossomas"

Os pseudolipossomas também podem formar emulsões devido à agregação de fosfolipídeos, mas têm uma ampla distribuição de tamanho de partícula (PDI> 0,5) e nenhuma estrutura vesicular, que pode ser rapidamente distinguida pela determinação de TEM ou EE.

2.Mal-entendido 2: "Contém Fosfolipídios = Lipossomas"

O núcleo dos lipossomas é "vesículas de bicamada", não apenas a adição de fosfolipídios. Os fosfolipídios em sistemas alimentares mistos simples atuam apenas como emulsificantes e não podem encapsular ou proteger ingredientes nutricionais.

3.Lembrete chave: EE é o indicador quantitativo do núcleo

Independentemente da morfologia, os sistemas com EE são basicamente julgados como pseudolipossomas (ou preparação de lipossoma de grau alimentício reprovada), que não podem alcançar liberação sustentada e melhoria de biodisponibilidade dos ingredientes nutricionais.

4.Esquema de Detecção Rápida para Oficinas de Produção de Alimentos

Adote a combinação "Centrifugação + Detecção UV": Após centrifugação a 10000rpm por 10 minutos, se a proporção da concentração de ingredientes nutricionais no sobrenadante para a concentração total for <10% e o sistema não tiver estratificação, pode ser inicialmente julgada como lipossomas qualificados de grau alimentício; caso contrário, é um sistema de mistura simples.

Resumo

A lógica central para distinguir lipossomas verdadeiros/falsos no campo nutracêutico é:Primeiro quantifique o efeito de encapsulamento e proteção dos ingredientes nutricionais por meio de EE e, em seguida, verifique a estrutura vesicular por meio da morfologia (TEM/microscopia), e, finalmente, confirmar o valor de aplicação prática através da estabilidade de processamento e curvas de liberação in vitro... É adequado para P & D e controle de qualidade de suplementos dietéticos e alimentos funcionais (por exemplo, lipossomas de DHA, lipossomas probióticos, lipossomas de polifenol de plantas). A combinação de "observação TEM EE (método HPLC)" é preferida, equilibrando a precisão e os requisitos de segurança de grau alimentício.